EM amilóide
―Métodos analíticos para detecção precoce da doença de Alzheimer a partir de exames de sangue―

Visão geral da EM amilóide

Amyloid MS é um novo método de análise de sangue desenvolvido pela Shimadzu Corporation e pelo National Center for Geriatrics and Gerontology (NCGG) para rastrear a doença de Alzheimer. A tecnologia visa prever a doença de Alzheimer em estágio inicial a partir de algumas gotas de sangue (cerca de 0,5 mL).

Doença de Alzheimer

Dado o envelhecimento progressivo da população nos últimos anos, o número de pacientes com demência tem aumentado. Em 2012, um em cada sete japoneses com 65 anos ou mais tinha demência, e espera-se que o número aumente ainda mais no futuro. Medidas para lidar com a demência se tornaram uma questão social, com o Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar do Japão e outros ministérios relevantes iniciando uma Estratégia Abrangente para Acelerar Medidas de Demência (Novo Plano Laranja). Consequentemente, há uma necessidade de estabelecer métodos para detecção precoce, tratamento e prevenção. Embora uma variedade de doenças possa causar demência (como demência de Alzheimer, demência cerebrovascular, demência com corpos de Lewy e demência frontotemporal), a demência de Alzheimer é responsável pelo maior número de pacientes, respondendo por cerca de 60% do total.

Embora as causas da demência de Alzheimer não tenham sido identificadas, várias patologias características podem ser observadas à medida que a doença progride. Por exemplo, a beta amiloide se acumula na superfície das células neuronais para formar placas senis, e proteínas tau se acumulam dentro das células neuronais para mudar as proteínas para uma forma semelhante a fiapos (emaranhados neurofibrilares).

Portanto, uma maneira de identificar as patologias da doença de Alzheimer antes que os sintomas de declínio cognitivo apareçam é visualizar e quantificar numericamente os níveis de acumulação de proteína beta amiloide e tau (quantidades, concentrações e distribuições). Por exemplo, exames de PET ou testes de marcadores do líquido cefalorraquidiano (LCR) podem ser realizados.

Além disso, Shimadzu colaborou com o Centro Nacional de Geriatria e Gerontologia (NCGG) para descobrir biomarcadores úteis para prever a quantidade de placas beta-amiloides a partir de algumas gotas de sangue.

Caminho para a detecção precisa de peptídeos relacionados a Aβ

Mesmo que altos níveis de placa beta amiloide tenham se acumulado, há altas concentrações de várias substâncias estranhas no sangue, e apenas uma quantidade muito pequena de beta amiloide está presente. Portanto, tem sido muito difícil detectar beta amiloide em amostras de sangue.

sabe-se que existem dois tipos principais de beta-amiloide. Um é o “Aβ1-40”, um peptídeo que consiste em 40 aminoácidos, e o outro é o “Aβ1-42”, que consiste em 42 aminoácidos. Além disso, sabe-se que existem pelo menos dez outros tipos com comprimentos diferentes. O ensaio imunoenzimático (ELISA) comumente usado agrupa vários comprimentos de beta-amiloide. Mesmo que os tipos Aβ1-40 e Aβ1-42 pudessem ser distinguidos, o ELISA não pode medir com precisão outros peptídeos relacionados a Aβ (um termo genérico para beta-amiloide de vários comprimentos).

Dado que os espectrômetros de massa são adequados para identificar e medir simultaneamente vários tipos de substâncias, Shimadzu decidiu tentar usar um sistema de espectrômetro de massa de alto desempenho que resultou da participação no Programa de Financiamento para P&D Inovador Líder Mundial em Ciência e Tecnologia (Programa FIRST) em 2010 para medir peptídeos relacionados a Aβ.

Apesar da dificuldade técnica de detectar pequenas quantidades de peptídeos relacionados a Aβ com um espectrômetro de massa, esse problema foi superado pelo desenvolvimento de um método de pré-tratamento para sangue. Além disso, biomarcadores que se correlacionam com o estado da placa beta-amiloide foram descobertos durante o trabalho de pesquisa conjunto com o NCGG, o que levou ao desenvolvimento bem-sucedido da primeira tecnologia do mundo que pode prever o acúmulo de beta-amiloide usando uma amostra de sangue.

• 

  Adquirir sangue

• 

• 

  Pré-tratamento de sangue

• 

• 

  Analisar massas

• 

• 

  Analisar peptídeos relacionados a Aβ

Inovação 1 — Método de pré-tratamento de sangue

Para detectar com precisão as quantidades de cada tipo de peptídeo relacionado ao Aβ, Naoki Kaneko, da Shimadzu, tentou uma ampla variedade de métodos de pré-tratamento do sangue.
Por fim, ele encontrou um método que envolve o uso de um anticorpo especial com um epítopo para uma sequência dentro de peptídeos relacionados a Aβ e a realização de duas etapas sucessivas de purificação por afinidade.
Selecionando um surfactante ideal para reações antígeno-anticorpo e usando o reagente ideal para cada etapa, incluindo soluções ácidas contendo um surfactante para a primeira etapa e um solvente orgânico para a segunda etapa, usando uma quantidade apropriada de solução para promover o contato com anticorpos e fazendo outros ajustes adequados, ele descobriu um método para extrair apenas peptídeos relacionados a Aβ do sangue e detectá-los com uma relação S/N suficientemente alta usando um espectrômetro de massa.

Este método, que combina os pontos fortes da Shimadzu em tecnologia de anticorpos e tecnologia de espectrometria de massa de alto desempenho com base no uso de uma fonte de íons MALDI ^*, pode separar e medir 22 tipos de peptídeos relacionados a Aβ. Os 22 tipos incluem até oito novos tipos que nunca haviam sido confirmados como existentes no sangue antes.

2. Método para avaliar os níveis de acumulação de beta-amiloide (biomarcadores)

Usando o pré-tratamento de sangue e o sistema de espectrômetro de massa preciso, 22 tipos de peptídeos relacionados a Aβ, incluindo oito tipos recém-descobertos, podem ser medidos. Então, como os dados resultantes podem ser usados para a detecção precoce da demência de Alzheimer?
Para obter esse conhecimento, visitamos o NCGG e iniciamos uma pesquisa colaborativa com o Dr. Katsuhiko Yanagisawa, uma autoridade líder em pesquisa sobre Alzheimer.

Para discriminar entre indivíduos com resultados positivos e negativos com base em um critério claro na pesquisa clínica, o Dr. Yanagisawa propôs uma pesquisa de biomarcadores usando resultados de tomografia por emissão de pósitrons (PET) Aβ em vez de usar a abordagem típica baseada em entrevistas com pacientes.
Um ano e meio após o início da pesquisa colaborativa, descobrimos a tendência da quantidade do recém-descoberto peptídeo APP669-711 ser maior do que Aβ1-42 conforme a doença de Alzheimer progredia. Em outras palavras, isso sugeriu que, ao usar APP669-711/Aβ1-42 como um novo biomarcador, pode ser possível discriminar com precisão entre pacientes com e sem patologias de Alzheimer (placas beta amiloides).

A razão pela qual a proporção de intensidade entre Aβ1-42 e APP669-711 varia dependendo do estado de acumulação de beta-amiloide é presumivelmente devido à diferença na capacidade de agregação entre os dois peptídeos.

Mesmo em indivíduos saudáveis, parte do Aβ1-42 produzido no cérebro vaza para o líquido cefalorraquidiano ou para o sangue.
Quando o beta amiloide começa a se acumular no cérebro, o Aβ1-42 produzido se liga sucessivamente (agrega) ao beta amiloide, o que resulta em menos vazamento para o sangue. Em contraste, o APP669-711 tem uma sequência de aminoácidos diferente em cada extremidade, o que reduz significativamente o nível de autoagregação em comparação ao Aβ1-42. Consequentemente, é menos provável que se ligue ao beta amiloide, com presumivelmente uma proporção fixa vazando para o sangue, independentemente dos níveis de acumulação de beta amiloide no cérebro.
Além disso, a quantidade de vazamento de Aβ1-42 não só varia dependendo dos níveis de acumulação de beta amiloide, mas também é afetada pela condição geral do indivíduo. Ao calcular a razão versus vazamento de APP669-711 afetado da mesma forma, os efeitos de corpo inteiro podem ser eliminados para isolar apenas as variações causadas pela acumulação de beta amiloide.

As tecnologias, produtos e outras informações indicadas destinam-se a fins de pesquisa.
Somente para uso em pesquisa. Não para uso em procedimentos de diagnóstico.

Co-criação

A tecnologia descrita acima foi estabelecida pela combinação da experiência da Shimadzu em tecnologia de espectrometria de massa com o conhecimento da pesquisa sobre demência no Centro Nacional de Geriatria e Gerontologia.
Link para o site do Centro Nacional de Geriatria e Gerontologia