Esclerosis múltiple amiloide
―Métodos analíticos para la detección temprana de la enfermedad de Alzheimer a partir de análisis de sangre―

Descripción general de la EM amiloide

La esclerosis múltiple amiloide es un nuevo método de análisis de sangre desarrollado por Shimadzu Corporation y el Centro Nacional de Geriatría y Gerontología (NCGG) para detectar la enfermedad de Alzheimer. La tecnología tiene como objetivo predecir la enfermedad de Alzheimer en etapa temprana a partir de unas pocas gotas de sangre (aproximadamente 0,5 ml).

Enfermedad de Alzheimer

En los últimos años, el número de pacientes con demencia ha aumentado debido al progresivo envejecimiento de la población. En 2012, uno de cada siete japoneses de 65 años o más padecía demencia, y se espera que esta cifra siga aumentando en el futuro. Las medidas para abordar la demencia se han convertido en un problema social, y el Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar Social del Japón y otros ministerios pertinentes han iniciado una Estrategia Integral para Acelerar las Medidas contra la Demencia (Nuevo Plan Naranja). Por consiguiente, es necesario establecer métodos de detección temprana, tratamiento y prevención. Aunque existen diversas enfermedades que pueden causar demencia (como la demencia de Alzheimer, la demencia cerebrovascular, la demencia con cuerpos de Lewy y la demencia frontotemporal), la demencia de Alzheimer es la que afecta a la mayor cantidad de pacientes, con un 60 % del total.

Aunque no se han identificado las causas de la demencia de Alzheimer, se pueden observar varias patologías características a medida que la enfermedad progresa. Por ejemplo, la beta amiloide se acumula en la superficie de las células neuronales para formar placas seniles, y las proteínas tau se acumulan en el interior de las neuronas para transformar las proteínas en una forma similar a la pelusa (ovillos neurofibrilares).

Por ello, una forma de identificar las patologías de la enfermedad de Alzheimer antes de que aparezcan los síntomas de deterioro cognitivo es visualizar y cuantificar numéricamente los niveles de acumulación de proteína beta amiloide y tau (cantidades, concentraciones y distribuciones). Por ejemplo, se pueden realizar exploraciones PET o pruebas de marcadores del líquido cefalorraquídeo (LCR).

Además, Shimadzu colaboró con el Centro Nacional de Geriatría y Gerontología (NCGG) para descubrir biomarcadores útiles para predecir la cantidad de placas beta amiloide a partir de unas pocas gotas de sangre.

El camino hacia la detección precisa de péptidos relacionados con Aβ

Aunque se han acumulado niveles elevados de placa de beta amiloide, en la sangre hay concentraciones elevadas de diversas sustancias extrañas y solo hay una cantidad muy pequeña de beta amiloide. Por lo tanto, ha sido muy difícil detectar beta amiloide en muestras de sangre.

Se sabe que existen dos tipos principales de beta amiloide: uno es el “Aβ1-40”, un péptido que consta de 40 aminoácidos, y el otro es el “Aβ1-42”, que consta de 42 aminoácidos. Además, se sabe que existen al menos otros diez tipos con diferentes longitudes. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de uso común agrupa múltiples longitudes de beta amiloide. Incluso si se pudieran distinguir los tipos Aβ1-40 y Aβ1-42, el ELISA no puede medir con precisión otros péptidos relacionados con Aβ (un término genérico para beta amiloide de varias longitudes).

Dado que los espectrómetros de masas son adecuados para identificar y medir simultáneamente múltiples tipos de sustancias, Shimadzu decidió intentar utilizar un sistema de espectrómetro de masas de alto rendimiento que resultó de la participación en el Programa de Financiamiento para I+D innovador líder mundial en ciencia y tecnología (Programa FIRST) en 2010 para medir péptidos relacionados con Aβ.

A pesar de la dificultad técnica de detectar pequeñas cantidades de péptidos relacionados con Aβ con un espectrómetro de masas, ese problema se superó mediante el desarrollo de un método de pretratamiento de la sangre. Además, durante el trabajo de investigación conjunto con NCGG se descubrieron biomarcadores que se correlacionan con el estado de la placa de beta amiloide, lo que llevó al desarrollo exitoso de la primera tecnología del mundo que puede predecir la acumulación de beta amiloide utilizando una muestra de sangre.

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  Adquirir sangre

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  Pretratar la sangre

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  Analizar masas

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  Analizar péptidos relacionados con Aβ

Innovación 1: método de pretratamiento de la sangre

Para detectar con precisión las cantidades de cada tipo de péptido relacionado con Aβ, Naoki Kaneko de Shimadzu probó una amplia variedad de métodos de pretratamiento de sangre.
Finalmente, encontró un método que implica el uso de un anticuerpo especial con un epítopo para una secuencia dentro de los péptidos relacionados con Aβ y la realización de dos pasos sucesivos de purificación por afinidad.
Al seleccionar un surfactante óptimo para las reacciones antígeno-anticuerpo y usar el reactivo óptimo para cada paso, incluyendo soluciones ácidas que contienen un surfactante para el primer paso y un solvente orgánico para el segundo paso, usando una cantidad apropiada de solución para promover el contacto con los anticuerpos y haciendo otros ajustes adecuados, descubrió un método para extraer solo péptidos relacionados con Aβ de la sangre y detectarlos con una relación S/N suficientemente alta usando un espectrómetro de masas.

Este método, que combina las fortalezas de Shimadzu en tecnología de anticuerpos y la tecnología de espectrometría de masas de alto rendimiento basada en el uso de una fuente de iones MALDI ^*, puede separar y medir 22 tipos de péptidos relacionados con Aβ. Los 22 tipos incluyen incluso ocho tipos nuevos cuya existencia en la sangre nunca antes se había confirmado.

2. Método para evaluar los niveles de acumulación de beta amiloide (biomarcadores)

Mediante el uso del sistema de pretratamiento de sangre y del espectrómetro de masas de precisión, se pueden medir 22 tipos de péptidos relacionados con Aβ, incluidos ocho tipos recién descubiertos. Entonces, ¿cómo se pueden utilizar los datos resultantes para la detección temprana de la demencia de Alzheimer?
Para adquirir ese conocimiento, visitamos el NCGG y comenzamos una investigación colaborativa con el Dr. Katsuhiko Yanagisawa, quien es una autoridad líder en la investigación del Alzheimer.

Para discriminar entre sujetos con resultados positivos y negativos basándose en un criterio claro en la investigación clínica, el Dr. Yanagisawa propuso una investigación de biomarcadores utilizando los resultados de la exploración PET-Aβ en lugar de utilizar el enfoque típico basado en entrevistas a pacientes.
Un año y medio después del inicio de la investigación colaborativa, descubrimos que la cantidad del péptido recién descubierto APP669-711 tenía una tendencia a ser mayor que la de Aβ1-42 a medida que avanzaba la enfermedad de Alzheimer. En otras palabras, esto sugería que, utilizando APP669-711/Aβ1-42 como nuevo biomarcador, podría ser posible discriminar con precisión entre pacientes con y sin patologías de Alzheimer (placas de beta amiloide).

La razón por la que la relación de intensidad entre Aβ1-42 y APP669-711 varía dependiendo del estado de acumulación de beta amiloide se debe presumiblemente a la diferencia en la capacidad de agregación entre los dos péptidos.

Incluso en individuos sanos normales, parte del Aβ1-42 producido en el cerebro se filtra al líquido cefalorraquídeo o a la sangre.
Cuando la beta amiloide comienza a acumularse en el cerebro, el Aβ1-42 producido se une sucesivamente (se agrega) a la beta amiloide, lo que da como resultado una menor fuga a la sangre. Por el contrario, la APP669-711 tiene una secuencia de aminoácidos diferente en cada extremo, lo que reduce significativamente el nivel de autoagregación en comparación con el Aβ1-42. En consecuencia, es menos probable que se una a la beta amiloide, con una proporción presumiblemente fija de fugas a la sangre, independientemente de los niveles de acumulación de beta amiloide en el cerebro.
Además, la cantidad de pérdida de Aβ1-42 no solo varía en función de los niveles de acumulación de beta amiloide, sino que también se ve afectada por el estado general del individuo. Al calcular la relación entre la pérdida de APP669-711 afectada de la misma manera, se pueden eliminar los efectos en todo el cuerpo para aislar solo las variaciones causadas por la acumulación de beta amiloide.

Las tecnologías, productos y demás información indicadas están destinadas a fines de investigación.
Solo para uso en investigación. No apto para procedimientos de diagnóstico.

Co-creación

La tecnología descrita anteriormente se estableció combinando la experiencia de Shimadzu en tecnología de espectrometría de masas con el conocimiento de la investigación sobre demencia en el Centro Nacional de Geriatría y Gerontología.
Enlace al sitio web del Centro Nacional de Geriatría y Gerontología